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技術文章 / article
【基因編輯產(chǎn)品新品上市】MET Ex14 skipping新添成員
原載自：m.linai8768.com[技術資料頻道] 2023-02-15 瀏覽次數(shù)：1941
Background
MET受體酪氨酸激酶是一種原癌基因，它的異常激活與腫瘤發(fā)生有關。各種潛在的機制，包括轉錄本中的改變、擴增、基因重排和外顯子跳躍，都是MET信號異常的原因。MET導致非小細胞肺癌(NSCLC)的關鍵改變之一是MET外顯子14( MET Ex 14)跳躍，這是一種驅(qū)動突變，約占肺腺癌的3-4%。MET Ex14跳躍導致功能活躍且穩(wěn)定的截短受體的形成，該受體缺乏負責MET泛素化的近膜調(diào)節(jié)域。至今為止全球已經(jīng)開發(fā)了幾種針對MET受體的MET激酶抑制劑，其中許多正在進行臨床試驗。
MET的結構
MET基因位于人類基因組的7q31號染色體上，跨越約125kbDNA，包含21個外顯子和20個內(nèi)含子。MET被編碼為前體，通過其a和b亞基之間的蛋白水解切割被修飾成成熟蛋白質(zhì)。 成熟的MET蛋白由一個小的a亞基(50kDa)和一個較大的b (145kDa)亞基組成，通過二硫鍵連接在一起。一個a亞基和b亞基的一部分共同構成異二聚體蛋白的胞外區(qū)，而b亞基的其余部分構成跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。
MET的細胞外成分包含三個結構域。N端Sema(Sema-phorin)是最大的結構域，包含500個殘基，包含a和b亞基的一部分。該結構域?qū)τ贛ET的配體結合、二聚化和激活至關重要。Sema結構域之后是叢蛋白-信號蛋白-整合素(PSI)結構域，包含四個二硫鍵，這對于配體結合受體的正確定位至關重要。PSI結構域通過免疫球蛋白-叢蛋白-轉錄因子結構域連接到MET的跨膜螺旋。受體的細胞內(nèi)部分包括近膜(JM)結構域、酪氨酸激酶(TK)催化結構域和C末端多功能停靠位點。其配體肝細胞生長因子(HGF)（也稱為分散因子）的結合對于激活激酶活性至關重要。HGF是迄今為止已知的MET受體配體，并以高親和力與受體結合。
Fig1.MET蛋白的結構
MET Ex14跳躍的機理
HGF與MET結合導致受體二聚化，導致激酶結構域中細胞內(nèi)殘基Y1234和Y1235自磷酸化，隨后在激酶結構域外的C端磷酸化另外兩個酪氨酸殘基Y1349和Y1356。C末端殘基的磷酸化導致對接位點的形成，隨后銜接子和效應蛋白，如GRB2（生長因子受體結合蛋白2）、GAB1（GRB2相關結合蛋白1）和SHC（含Src同源2結構域），與?？课稽c結合，觸發(fā)下游信號傳導。
2005年報道了NSCLC中MET Ex14的跳躍 。內(nèi)含子13的3' 剪接位點或內(nèi)含子14的5 '末端剪接位點的替換或缺失導致MET Ex14跳躍。在MET Ex14的剪接點處或剪接點附近發(fā)生的這種體細胞改變導致轉錄物中外顯子14的丟失和MET蛋白的合成以及JM結構域中47個氨基酸的框內(nèi)缺失（包括殘基Y1003)消融CBL介導的受體泛素化和降解。因此，MET Ex14跳躍導致MET蛋白水平升高，這可以驅(qū)動促進腫瘤發(fā)展的下游信號通路的激活。
Fig 2. MET Ex14跳躍的機理
MET Ex14跳躍的突變
根據(jù)文獻報告，在非小細胞肺癌中常見的導致MET Ex14跳躍的突變有如下幾種：
Fig 3. 常見導致MET Ex14跳躍的突變
同時在眾多的其他癌種中也發(fā)現(xiàn)很多，大約 3–4% 的 NSCLC 具有MET Ex14改變。在組織學亞型中， MET Ex14跳躍改變常見于肉瘤樣癌 (4.9–31%)，69–72腺鱗癌 (4–8%)、腺癌 (3–4%) 和鱗狀細胞癌 (2%)。此外，在腺癌中，主要的亞型是腺泡型 (35-52.9%) 或?qū)嵭詠喰?(35.3-53%)。臨床上， METEx14跳躍異常多見于高齡患者。
MET Ex14跳躍的檢測
一般而言，基于DNA和RNA的分子檢測是檢測METex14改變的方法?；贒NA的測序分析可以檢測MET改變，例如剪接位點的插入、缺失、點突變或重復，這些改變可能導致外顯子14跳躍。然而，METEx14跳躍與剪接位點中超過120個報告的序列變異有關，這使得僅使用基于DNA的檢測來檢測這些突變具有挑戰(zhàn)性。因此，對RNA轉錄本的分析可以驗證外顯子13和15之間的融合。在理想情況下，基于DNA和RNA的檢測可相互補充，以可靠地檢測METEx14改變。
Fig 4. 常見針對DNA和RNA檢測技術來識別MET Ex14跳躍的方法
MET Ex14跳躍的標準品
科佰生物利用基因編輯的方法，成功獲得多種MET Ex14跳躍的標準品，表現(xiàn)為在DNA層面出現(xiàn)剪切變異，在RNA層面出現(xiàn)14外顯子的缺失，部分產(chǎn)品羅列如下：
表1. 部分MET Ex14跳躍突變的產(chǎn)品
檢測數(shù)據(jù)如下（以c.3028+1_c.3028+9del為例）
AI-Edigene® MET Splice Site Mutation（c.3028+1_c.3028+9del）Reference Standard
Fig 5. DNA的sanger測序顯示c.3028+1_c.3028+9del
Fig 6. RNA的sanger測序發(fā)生14外顯子的缺失
Fig 7. DNA的ddPCR檢測，顯示突變頻率為*
Fig 8. RNA的ddPCR檢測，顯示拷貝數(shù)為1315.07 copies/ng
如上數(shù)據(jù)可知，不僅僅在DNA層面發(fā)生了剪切變異，在RNA層面也發(fā)生了變異，而且根據(jù)ddPCR的拷貝數(shù)數(shù)據(jù)顯示，MET表達也大大增加了。
科佰生物在使用基因編輯技術定制定點突變、插入、缺失、融合上有豐富的經(jīng)驗，歡迎大家一起溝通討論。
